Фото при выявление вич

Иркутский областной центр СПИД

Первые фотографии ВИЧ были показаны в статьях Монтанье и Галло, описывавших выделение ВИЧ в 1983 и 1984 гг, соответственно. В статье Барре-Синусси и Монтанье 1983 года, за которую они позже и получили Нобелевскую премию, приводится следующая картинка:

На этой картинке отчетливо видны вирусные частицы, проходящие сборку около клеточной мембраны — темные полукольцевые и кольцевые уплотнения. Монтанье и Синусси не увидели или не обратили внимания на характерную особенность ВИЧ, отличающую его от многих других вирусов: после отделения от клетки он «созревает» и внутри него образуется конусовидный капсид. В зависимости от того, как проходит через этот конус разрез, он может выглядеть как круг, треугольник или прямоугольник.

Зато в статье Галло, опубликованной годом позже, вирус видно намного лучше.

На панели А виден (на всю фотографию) макрофаг, на поверхности которого идет сборка новых вирусных частиц (плотных черных колец). Особенно хорошо этот процесс виден в правом верхнем углу, который увеличен на панели B. На панели C показан крупным планом почти отделившийся вирион. А на панели D показан созревший вирус, но разрез через его конусовидный капсид прошел так, что на фотографии он выглядит прямоугольным, а Галло в статье назвал его цилиндрическим.

С тех пор ВИЧ был сфотографирован бессчетное число раз. Ниже приведена лишь небольшая выборка из всего многообразия существующих фотографий.

Внимательно разглядываем вирус

Когда методы по наработке вируса были усовершенствованы, появилось множество детальных фотографий ВИЧ, на которых очень хорошо видна его структура.

По ссылке 2 видим следующую картинку:

Срез мозга пациента умершего от СПИДа. На панели А — клетка-макрофаг. Стрелками показаны необычные уплотнения, выпячивающиеся из клетки наружу — это новообразующиеся вирусы. На панели А1 — то же самое крупным планом, на панели С — два выпячивания из другого макрофага. На панели D мы видим целый ряд уже сформировавшихся и отделившихся вирусных частиц. У некоторых еще видна небольшая «ножка», соединяющая вирус и клетку. Только что отделившийся, незрелый, вирус имеет вид плотного черного кольца (на самом деле это конечно полый шар, но на срезе он выглядит как кольцо).

На панели B — интересное образование, несколько макрофагов слились в одну клетку. Это не вызвано вирусом, макрофаги имеют способность делать это сами при необходимости. Например, если им нужно «заглотить» особенно крупного микроба. Черные петли внутри клетки — это ядра макрофагов, а стрелкой указано место, где происходит сборка вируса. А вот на панели E мы видим несколько созревших вирусных частиц. Заметьте, что они выглядят иначе, чем незрелые — плотное кольцо по краю исчезло, зато в центре появилась новая структура — капсид вируса. В среднем вирусе хорошо видно, что капсид имеет форму усеченного конуса. Капсид в виде усеченного конуса — характеристичная черта ВИЧ, по которой его можно отличить от большинства других вирусов.

Когда вирус собирается в клетке, все его внутренние белки входят в состав двух длинных белков. Эти длинные белки имеют свойство прилипать к клеточной мембране. Поэтому во время сборки вируса и сразу после отпочковывания мы и видим плотный черный слой под мембраной. Когда вирус отделился от клетки, вирусная протеаза разрезает эти длинные белки на их составляющие компоненты (поэтому кольцо по краю исчезает). Высвобожденные белки самособираются в конусовидный капсид, внутри которого находится РНК вируса и его ферменты.

А в следующей статье 3 под микроскоп засунули биопсии лимфоузлов из людей с оппортунистической инфекцией P.carinii, которая изначально привела к обнаружению СПИДа в 1981 году.

На панели A буквой P помечен цист P.carnii. Стрелками — места образования вируса. (B) — два вируса отпочковываются от макрофага. Панель С — видны отличия вирусов от просто пузырьков, образованных P.carnii. Последние больше размером и имеют меньшую плотность. Панель D — вирусы внутри макрофагов, в вакуолях. До сих пор идут споры о том, может ли вирус там образовываться или это макрофаг его заглатывает.

Движемся дальше. Тщательное электронно-микроскопическое исследование вируса было сделано в 1988 году, ссылка 11. Следующие четыре картинки — из нее.

Картинка 4. (A) — нормальная H9 клетка (клеточная линия лимфоцитов). (B) — H9 клетка, зараженная ВИЧ. Морфология клетки радикально изменилась, вместо длинных отростков мы видим пузырьки, называемые blebs. Эта «пузырчатость» зараженных клеток хорошо видна в обычный микроскоп, но эти пузыри — не вирусы. Вирусы — это маленькие пузыречки между blebs. Картинка сделана сканирующим электронным микроскопом, поэтому получается трехмерная картина, но мы не можем заглянуть внутрь клетки.

Картинка 5. Та же самая клетка, только крупным планом. Тут вирусы видны очень хорошо.

Картинка 6. В этой же статье были сделаны и срезы. На панелях А и С — два разных изолята ВИЧ. Слева хорошо виден усеченный конус, а справа он оказался разрезан перпендикулярно оси и выглядит как круг. В центре — SIVmac, вирус иммунодефицита макак. Видно сходство. Обратите внимание на белки оболочки — выступающие наружу протуберанцы. Слева их практически нет, зато в центре и справа они хорошо видны. Тогда еще об этом не знали, но белок оболочки очень нестабилен и легко отваливается от вируса, возможно с образцом слева обошлись недостаточно нежно и вирус утерял его. Сейчас мы также знаем, что на вирусных частицах SIV белка оболочки обычно больше, чем на HIV, и он более стабильный.

И последняя картинка из этой статьи:

Картинка 7. Разные стадии образования вируса. Это, конечно же, не один и тот же вирус, а подборка для иллюстрации. Для электронной микроскопии образец приходится фиксировать и поэтому она может захватить лишь один момент в жизни каждого отдельного вируса.

Тут стоит упомянуть статью от немцев, которая тоже была опубликована в 1988 году, ссылка 13. В ней использовался интересный, и мне кажется, сейчас редко употребляемый, подход — surface replica electron microscopy. Клетки замораживают, потом замороженный образец раскалывают, выявляя структуры (подобно тому, как на сколах камня выявляются древние окаменелости). Затем на этот скол напыляют платину, а поверх нее — углерод. Затем образец размораживают и все биологические структуры уничтожают сильной кислотой. В итоге остается платиново-углеродный отпечаток, который уже и рассматривают под микроскопом.

Картинка 8. Видим примерно то же самое, что и в предыдущей статье. На зараженной клетке H9 появились blebs, а между ними и на них — большое количество новообразующихся вирусов.

Но видимо этот метод (а может просто буйное воображение), увели авторов этой статьи по ложному следу. Они разглядели некие регулярные структуры в устройстве вирусов, которые, как мы знаем сейчас, не существуют.

Картинка 9. Поиски (несуществующей) симметрии в устройстве ВИЧ.

Мы уже видели ВИЧ-1 и ВИО. Как насчет ВИЧ-2, Есть его фотографии? Конечно, есть 4.

Картинка 10. Клетка HUT78, зараженная ВИЧ-2. Видны уже обсуждавшиеся места сборки вируса и характерные конические капсиды в созревших вирусных частицах.

Еще одно довольно подробное исследование ВИЧ под электронным микроскопом было сделано в 1989 году 8. В нем есть несколько интересных картинок.

Картинка 11. На панели А мы видим уже знакомую нам картину. На панелях B и С авторы, видимо поверив статье от немцев, ищут какие-то регулярные структуры и тоже вроде бы что-то находят. Зато на панели D мы видим нечто интересное — это увеличение верхнего левого угла из панели А, в котором авторы заметили что срез прошел через белки оболочки вируса. Если присмотреться (и включить немного воображения), то можно увидеть что белок оболочки является тримером и поэтому имеет треугольную структуру на срезе. Мы к этому еще вернемся.

Картинка 12. Довольно много информации на ней. Сделанные по этим картинкам выводы частично подтвердились позже, а частично нет. Бывает. Наиболее интересные панели: (А) Слева незрелый вирус, справа — созревший. Видна разница в количестве белка оболочки, зрелый вирус утерял большую его часть. (E) Разнообразие форм вируса. Особенно интересна частица в правом нижнем углу, в которой образовалось два капсида. Такое редко случается в естественных условиях, это обычно артефакт производства вируса в клеточных линиях.

Кстати, о странных вирусах. Клетки MT4 отличаются тем, что вирус в них реплицируется как бешенный, раз в 10 быстрее, чем в других. Они просто все вздуваются производя огромные количества вирусных частиц. Ну и вирусы в результате часто получаются странные, как например в статье 7.

Картинка 13. Двойными стрелками показаны странные вирусные частицы, более крупные по размеру чем обычно и часто содержащие два капсида.

Зато в этих клетках можно наработать очень много вируса и потом аккуратно его почистить, слегка обработать детергентом (чтобы вскрыть вирусную мембрану) и получить красивые чистые капсиды.

Картинка 14. Хорошо видна конусовидная структура капсида ВИЧ.

Картинка 15. Тут мы имеем одно из подтверждений того, что наблюдаемые нами частицы действительно являются ВИЧ. Антитела к ВИЧ были связаны с частицами золота (черные точки) и нанесены на срез. Несвязавшиеся частицы были смыты. Появление черных точек (частицы золота) над этим пузырьком говорит о том, что в нем находятся белки ВИЧ. Подобных картинок еще много в статье 10, но я их приводить тут уже не буду.

Кстати, помните намеки на тройную организацию белка оболочки ВИЧ на картинке 5? На картинке из статьи 12 это видно намного лучше.

Картинка 16. 3D томография электронным микроскопом позволяет делать множественные «срезы» через вирус. Тут от верхнего левого угла к нижнему правому мы движемся через срезы вирусной частицы, сделанные сверху вних. Видно, что на поверхности вируса находится белок оболочки, являющийся тримером (треугольная форма). На срезах через середину вируса видно, что белок оболочки сбоку выглядит как грибок — тонкая ножка около мембраны заканчивается шляпкой.

На этом мы заканчиваем просто разглядывание вируса и переходим к его изучению.

Изучаем вирус

Сила «обратной генетики» в микробиологии заключается в том, что имея геном вируса мы можем делать в нем мутации и смотреть, что с ним происходит, как это было сделано в статье 5.

Картинка 17. (А) и (B) Нормальный вирус. (C) и (D) — вирус, который не может созревать, потому что у него мутирована протеаза. Как и ожидалось, конусов не видно. (E) — вирус, который может созревать, но не может собирать нормальный капсид. Вместо него во всех вирусах наблюдался шарообразный капсид. (F-H) — мутант, которому что-то изрядно поломали, так что он вообще вирусные частицы собирать не может.

Вмешиваться в образование вируса можно и влияя на клетку. В статье [06] к клеткам добавляли ингибитор протеосом — специальных комплексов в которых в клетке разрушаются белки. Вирус при этом образовывался более-менее нормальный, но количественно было заметно увеличение незрелых частиц и частиц на очень поздней стадии сборки, но все еще соединенных с клеткой мостиком.

Можно также вмешиваться в сборку вируса подсовывая ему дефектные версии клеточных белков, которые обычно помогают вирусной сборке. Так было сделано в статье 1.

Картинка 19. (А) — вирус в обычных клетках. (B-D) — вирус в клетках с дефектной версией белка TSG101. Видно большое количество незрелых вирусных частиц, а также «дуплетов», когда два вируса соединены друг с другом.

И, наконец, можно исследовать противоборство вируса и клеточных антивирусных систем [09]. Например, антивирусный белок tetherin не дает вирусу покинуть зараженную клетку. ВИЧ имеет свой собственный белок, который позволяет ему инактивировать tetherin и нормально отпочковываться.

Картинка 20. (D) — обычная клетка (без белка tetherin), обычный вирус. (E) — обычная клетка, мутантный вирус, неспособный бороться с tetherin (отличий с D не много). (F) — клетка с белком tetherin, и обычный вирус. Видно некоторое увеличение количества вируса на поверхности, но в целом ВИЧ справляется с tetherin и покидает клетку нормально. (G) — клетка с белком tetherin и вирус, неспособный с этим белком бороться. Видно огромное скопление вирусных частиц на поверхности клетки.

Заключение

Видео от производителя электронных оптических приборов FEI Company

Ну вот, надеюсь этих 20 картинок достаточно для того, чтобы убедить любого нормального человека в том, что фотографии ВИЧ конечно же существуют и существовали практически с самого начала исследования этого вируса. Когда отрицатели ВИЧ говорят о том, что «вируса никто не видел», они тривиально лгут в надежде на то, что никто не потрудится проверить это их утверждение. Это, впрочем, относится и к остальным их аргументам. Не повторяйте за ними всякие глупости и другим не давайте повторять.

Список литературы

Этот список ни в коей мере не является исчерпывающим или как-то специально отобранным. Я просто сделал поиск по ключевым словам HIV electron microscopy, прошелся по первым выпавшим ссылкам и отобрал те статьи, которые показались мне интересными. Существуют десятки, если не сотни, статей про ВИЧ, в которых используется тот или иной вариант электронной микроскопии. Тут представлена лишь небольшая выборка из этого разнообразия.

Автор: Yegor Voronin/316217

Источник