Механизм репликации вируса гепатита а

Вирусный гепатит А — инфекционная болезнь человека, характеризующаяся преимущественным поражением печени и проявляющаяся клинически интоксикацией и желтухой. Вирус гепатита А был обнаружен в 1973 г. С. Фейнстоном (и др.) с помощью метода иммунной электронной микроскопии и путем заражения обезьян — шимпанзе и мармозеток. Суть метода иммунной электронной микроскопии состоит в том, что к фильтрату испражнений больного гепатитом А добавляют специфические антитела (сыворотку реконвалесцента) и осадок подвергают электронной микроскопии. Благодаря взаимодействию вирусов со специфическими антителами они подвергаются специфической агрегации. Их в этом случае легче обнаружить, а агрегация под влиянием антител подтверждает специфичность возбудителя. Открытие С. Фейнстона было подтверждено в опытах на добровольцах.

Вирус гепатита А имеет сферическую форму, диаметр вириона — 27 нм. Геном представлен однонитевой позитивной РНК с м. м. 2,6 МД. Суперкапсид отсутствует. Тип симметрии кубический — икосаэдр. Капсид имеет 32 капсомера, он образован четырьмя полипептидами (VP1-VP4). По своим свойствам вирус гепатита А отнеси к роду Heparnovirus, семейству Picornaviridae. В антигенном отношении вирус гепатита A (HAV — hepatitis A virus) является однородным. HAV хорошо размножается в организме шимпанзе, павианов, гамадрилов и игрунковых обезьян (мармозеток). Длительное время вирус не умели культивировать. Лишь в 1980-х гг. удалось получить культуры клеток, в которых HAV размножается. Вначале для этих Целей использовали перевиваемые линии клеток почки эмбриона макака-резус (культура FRhK-4), а сейчас — перевиваемую линию клеток почек зеленых мартышек (культура 4647).

Согласно рекомендациям экспертов ВОЗ, принята следующая номенклатура маркеров вируса гепатита А: вирус гепатита А — НАУ антитела к вирусу гепатита А: анти-НАV IgМ и анти-НАV IgG.

НАV представляет собой мелкие частицы диаметром 27-30 нм, имеющие икосаэдральную симметрию и обладающие гомогенностью. На электронограмме, полученной с помощью метода иммунной агрегации, обнаруживаются электронно-плотные частицы с поверхностно расположенными симметрично уложенными капсомерами. При негативном контрастировании в препаратах выявляются как полные, так и пустые частицы. Нуклеокапсид НАV, в отличие от такового при гриппе, не имеет поверхностных выступов и оболочки. Важно также, что вирион НАV не имеет сердцевидной структуры.

По своим физико-химическим свойствам вирус гепатита А отнесен к семейству пикорнавирусов, роду энтеровирусов с порядковым номером 72. Однако такая таксономия оказалась слишком непривычной, и ВОЗ сочла возможным оставить терминологию «вирус гепатита А».

Как и все вирусы семейства Рicornaviridае, вирус гепатита А содержит рибонуклеиновую кислоту. В некоторых лабораториях показана возможность клонирования генома вируса гепатита А, что открывает перспективу получения вакцинных препаратов.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Резистентность вируса гепатита А

Вирус относительно устойчив к высокой температуре, кислотам, жирорастворителям (отсутствуют липиды), дезинфицирующим средствам, хорошо переносит низкую температуру. Все это способствует длительному сохранению его во внешней среде. При комнатной температуре он выживает несколько недель, при 60 °С частично утрачивает инфекциозность через 4-12 ч, полностью — через несколько минут при 85 °С. Высокорезистентен к хлору, благодаря чему способен проникать в водопроводную воду через барьеры водоочистных сооружений.

Суммируя все данные, можно следующим образом охарактеризовать вирус гепатита А:

• естественный хозяин — человек;
• экспериментальные животные — мармозеты, шимпанзе;
• источник инфицирования — фекалии;
• заболевание — эпидемично и эндемично;
• путь передачи — фекально-оральный;
• инкубационный период — 14-40 сут;
• переход в хронический гепатит — не отмечается.

Иммунологические свойства НАV таковы:

• Прототииные штаммы — Ms-l, СR-326, GВG. Все иммунологически подобны или идентичны;
• Антитела — IgМ и IgG, продуцируются в ответ на введение структурных белков вируса и протективны;
• I Тротективное действие человеческого сывороточного у-глобулина — предохраняет или аттенуирует заболевание при условии введения до заражения или в течение инкубационного периода.

Физико-химическая характеристика НАУ следующая:

• Морфология — безоболочечная сферическая частица с кубической симметрией, капсид состоит из 32 капсомеров;
• Диаметр — 27-30 нм;
• Плотность в СsС1 (г/см3) — 1,38-1,46 (открытые частицы), 1,33-1,34 (зрелый вирион), 1,29-1,31 (незрелые вирионы, пустые частицы);
• Коэффициент седиментации — 156-160 зрелых вирионов;
• Нуклеиновая кислота — однонитевая, линейная РНК;
• Относительная молекулярная масса — 2,25 106-2,8 106КД;
• Число нуклеотидов — 6,500-8,100.

Стабильность НАV при физико-химических воздействиях следующая:

• Хлороформ, эфир — стабилен;
• Хлор, 0,5-1,5 мг/л, 5 °С,15 мин — частичная инактивация;
• Хлорамин, 1 г/л, 20 °С.,15 мин — полная инактивация;
• Формалин, 1:4000, 35-37 °С, 72 ч — полная инактивация, 1:350, 20 °С, 60 мин — частичная инактивация.

Температура:

• 20-70 °С — стабилен;
• 56 °С, 30 мин — стабилен;
• 60 °С, 12 ч — частичная инактивация;
• 85 °С, 1 мин — полная инактивация;
• Автоклавирование, 120 °С. 20 мин — полная инактивация;
• Сухой жар, 180 °С, 1ч — полная инактивация;
• УФО, 1,1 Вт, 1 мин — полная инактивация.

Представленные данные показывают, что по своим физико-химическим свойствам вирус гепатита А ближе всего стоит к энтеровирусам. Подобно другим энтеровирусам, HAV устойчив к воздействию многих дезинфицирующих растворов, полностью инактивируется в течение нескольких минут при 85 °С и автоклавировании.

Доказано, что вирус гепатита А может репродуцироваться в первичных и перевиваемых монослойных линиях культур клеток человека и обезьян. Особенно активная репродукция вируса гепатита А в культурах in vitro наблюдается при использовании в качестве исходного материала экстрактов печени больных обезьян. Следует, однако, отметить, что во всех опытах по репродукции вируса гепатита А на культурах in vitro обращает на себя внимание длительный инкубационный период при первичных пассажах (до 4 -10 нед), в дальнейшем накопление вирусного генетического материала нарастает, но абсолютные величины остаются весьма незначительными, что дает основание многим исследователям говорить о неполной репликации вируса гепатита А в тканевых культурах.

Резюмируя данные литературы по репродукции вируса гепатита А внетканевых культурах, можно сказать, что факт длительного переживания HAV in vitro не подлежит сомнению. Оптимальные условия для стабильного высокого уровня репликации вируса окончательно не выявлены, а это сдерживает изучение его биологических свойств, получение источника реагентов для производства диагностику адов и конструирования вакцин.

Вместе с тем в литературе можно найти и более оптимистические суждения о данной проблеме. Решение всех вопросов, связанных с культивированием вируса гепатита А, — дело ближайшего будущего. При изучении оптимальных условий размножения HAV в культуре клеток почки эмбриона макаки-резус выявлены две фазы: фаза продукции инфекционного вируса (до 6-8 сут на уровне 5-го пассажа) и фаза интенсивного накопления вирусного антигена. Показано также, что наиболее существенное накопление вирусного антигена происходит в условиях так называемого роллерного культивирования (вращающиеся флаконы). Этот путь открывает широкие возможности получения культурального антигена в больших количествах, а следовательно, появится исходный материал для приготовления диагностических систем и изготовления вакцинальных препаратов.

Эпидемиология гепатита А

Вирус гепатита А обладает высокой патогенностью для человека. По заключению ВОЗ (1987 г.), для возникновения болезни достаточно заражения всего одним вирионом. Однако практическая заражающая доза, вероятно, значительно выше. Источником инфекции является только инфицированный человек. Вирус выделяется в большом количестве с испражнениями за 12-14 дней до появления желтухи и в течение 3 нед. желтушного периода. Существенных различий в выделении возбудителя у больных желтушными, безжелтушными и бессимптомными формами гепатита А не выявлено. Способ заражения — фекально-оральный, главным образом водный, а также бытовым и пищевым путем. Способ заражения — фекально-оральный, главным образом водный, а также бытовым и пищевым путем. Основной (первичный) путь передачи вируса — водный. Возможно также заражение воздушно-капельным путем. Восприимчивость населения всеобщая. Болеют преимущественно дети в возрасте до 14 лет. Болезнь имеет выраженную осенне-зимнюю сезонность.

[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]

Симптомы гепатита А

Инкубационный период варьирует от 15 до 50 дней, что зависит от величины заражающей дозы вируса, но в среднем составляет 28-30 дней. Попав в организм, вирус гепатита А размножается в регионарных лимфатических узлах, проникает в кровь, а затем в клетки печени и вызывает острый диффузный гепатит, который сопровождается поражением гепатоцитов и ретикулоэндотелиальных элементов печени и снижением ее дезинтоксикационной и барьерной функций. Повреждение гепатоцитов возникает не за счет прямого действия вируса, а в результате иммунопатологических механизмов. Наиболее типичной картиной гепатита А является острая желтушная циклическая форма: инкубационный период, продромальный (преджелтушный), желтушный период и реконвалесценция. Однако в очагах инфекции выявляется большое количество больных с безжелтушными и бессимптомными формами инфекции, число которых значительно преобладает над желтушными («феномен айсберга»).

Постинфекционный иммунитет прочный и длительный, обусловлен вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти.

Микробиологическая диагностика гепатита А

Диагностика гепатита А (кроме заражения животных — шимпанзе, мармозет, павианов, которых у нас нет) основана на различных иммунологических методах: РСК, иммунофлуоресцентный метод, гемагглютинация иммунного прилипания (комплекс вирусный антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах и вызывает их склеивание). Однако возможности применения этих методов ограничены из-за отсутствия специфических вирусных антигенов, а реакция иммунофлуоресценции требует биоптатов печени, что нежелательно. Надежным и специфическим является метод иммунной электронной микроскопии, однако он очень трудоемкий. Поэтому пока единственной приемлемой иммунологической реакцией является метод иммуносорбентного анализа твердой фазы в виде ИФМ или РИМ, особенно в модификации «захвата» иммуноглобулинов класса М. В нашей стране для этой цели предложена тест-система — «ДИАГН-А-ГЕП». Принцип работы этой тест-системы следующий. На стенках полистироловых луночек сорбируются вначале антитела к иммуноглобулинам класса М (антииммуноглобулины М), затем добавляется исследуемая сыворотка больного. Если в ней есть антитела класса IgM, они будут связываться ан-ти-антителами М, затем добавляется специфический вирусный антиген (вирус гепатита А), который получают путем выращивания в культуре клеток. Система промывается, и к ней добавляются противовирусные антитела, меченные пероксидазой хрена. Если произошло взаимодействие всех четырех компонентов системы, возникает четырехслойный «сэндвич»:

• антииммуноглобулины М,
• иммуноглобулины М (против вируса гепатита А — в исследуемой сыворотке больного),
• вирусный антиген,
• антивирусные антитела, меченные ферментом.

Для обнаружения этого комплекса в луночки добавляют субстрат для фермента. Под влиянием фермента он разрушается, и образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски можно измерить количественно с помощью спектрофотометра или фотоколориметра.

Преимущество метода «захвата» IgM состоит в том, что антитела этого класса иммуноглобулинов появляются при первичном иммунном ответе и свидетельствуют об активной стадии инфекции, они исчезают после перенесенного заболевания. Противовирусные антитела, относящиеся к классу IgG, напротив, длительное время сохраняются после перенесенного заболевания, обеспечивая приобретенный иммунитет. Для обнаружения вируса гепатита А предложен метод ДНК-зонда: используют в качестве зонда ДНК комплементарную вРНК.

Лечение гепатита А

В связи с тем что при вирусных гепатитах нарушена продукция интерферонов, лечение гепатита А основано на применении интерферона и индуктора его эндогенного синтеза амиксин.

Специфическая профилактика гепатита А

Ранее широко применявшаяся серопрофилактика гепатита А с помощью гаммаглобулина себя не оправдала, поэтому основной упор был сделан на проведение вакцинопрофилактики, проводится прививка от гепатита А. С этой целью разрабатываются и уже используются различные варианты вакцин. В России эффективная вакцина против гепатита А была получена еще в 1995 г., и сейчас она успешно применяется.